本发明属于杀灭寄生虫药物技术领域,公开了一种五没食子酰葡萄糖在杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物的应用,特别是用于杀灭多子小瓜虫,在有效剂量范围能实现100%杀灭。五没食子酰葡萄糖无残留、无污染、对人体无毒,开发成防治鱼类体外寄生纤毛虫的新型环保药物的潜力巨大,应用前景广阔。
1.五没食子酰葡萄糖在杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述药物制成药液或粉剂。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述鱼类体外寄生纤毛虫指多子小瓜虫。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述五没食子酰葡萄糖的有效浓度大于等于20mg每升鱼类养殖用水。技术领域
本发明属于杀灭寄生虫药物技术领域,特别涉及一种五没食子酰葡萄糖在杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物的应用。
背景技术
寄生纤毛虫病是水产养殖中一类重要疾病,而小瓜虫病就是由寄生纤毛虫中的多子小瓜虫引起的一种疾病,又称白点病,是水产养殖生产中的常见病、多发病,可造成严重经济损失。对多子小瓜虫病的防治,长期以来,以化学药物为主,如孔雀石绿、汞制剂(硝酸亚汞和醋酸亚汞)和甲醛等。但由于这些化学药物易残留、污染环境和危害人类健康,多数已在食用鱼上禁用。如孔雀石绿和汞制剂,因其对人体有较强的致畸和致癌效应而被禁用。因此,寻找新的替代药物防治小瓜虫病迫在眉睫。我国中草药植物资源丰富,研究发现有部分中草药植物含有杀虫活性化合物,这些天然杀虫化合物无残留无污染,可以开发成安全环保的新型渔用杀虫药物,从而解决上述化学药物残留污染问题。五没食子酰葡萄糖(PGG)是一种来自于多种药用植物中的可水解多酚鞣酸化合物,其结构式为:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="672"/>分子式:C₄₁H₃₂O₂₆,分子量:940,为无色透明粉术,三氯化铁显深蓝色。PGG已知用途:专利CN201210151295.3公开了PGG对内脏痛、中枢痛及外周痛都具有明显的镇痛活性;另据文献报道,PGG有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、拮抗内毒素、抑制恶性肿瘤等作用。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足,本发明的目的在于提供五没食子酰葡萄糖在杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用,特别是在制备杀灭多子小瓜虫药物的新应用。本发明的目的通过下述方案实现:五没食子酰葡萄糖在杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。所述药物制成药液或粉剂。所述鱼类寄生纤毛虫指多子小瓜虫。所述五没食子酰葡萄糖的有效浓度大于等于20mg每升鱼类养殖用水。本发明的机理:PGG是通过损伤纤毛虫细胞膜,增加膜的通透性,让水分容易通过细胞膜进入虫体内涨破虫体致死。本发明相对于现有技术具有如下优点及有益效果:(1)本发明首次把PGG应用于制备杀灭鱼类体外寄生虫药物,特别是用于杀灭多子小瓜虫,在有效剂量范围能实现100%杀灭寄生虫,防治小瓜虫病;(2)PGG无残留、无污染、对人体无毒,其对鱼的半致死浓度为杀灭多子小瓜虫半有效浓度的5倍,对鱼安全;(3)PGG来源广泛,PGG的制备工艺简单,具有广阔应用前景。
附图说明
图1为用吖啶橙和碘化丙啶混合染色的多子小瓜虫感染性幼虫形态,其中,a和b为感染性幼虫活体,c和d为10mg/LPGG处理致死的感染性幼虫。图2为用吖啶橙和碘化丙啶混合染色的多子小瓜虫成虫形态,其中,a为感染性成虫活体,b为80mg/LPGG处理致死的成虫。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细描述,但本发明的实施方式不限于此。实施例1:PGG药物对多子小瓜虫感染性幼虫的杀灭作用(1)PGG药物的配置:用电子天秤称取0.1gxa0PGG粉,用1mL超纯水溶解,搅拌均匀,得到浓度为100mg/mL的1级储备液,从1级储备液中取20μL,加入9.98mL超纯水,搅拌均匀制得浓度为200mg/L的2级储备液,从该2级储备液中取1600μL加入到6400μL超纯水中混匀制得PGG浓度为40mg/L的PGG药物。(2)在96孔板第一排孔中每孔加入步骤(1)制备得到的PGG药物400μL,从第一排孔取200μL,加入第二排孔,接着再加入200μL超纯水混匀,得到浓度为20mg/L的药液,从第二排孔取出200μL加入第三排孔,再加入200μL超纯水混匀,得到浓度为10mg/L的药液,如此用二倍梯度稀释法在96孔板中制备不同浓度的药液,最终得到浓度分别为40、20、10、5和2.5mg/L,体积均为200μL的五排不同浓度的药液,对照不加药,只加200μL超纯水。再将200μL含有300个多子小瓜虫幼虫的水溶液分别加入上述装有药液的96孔板中,使最终药液浓度依次为20、10、5、2.5、1.25和0(对照)mg/L。每组设置5个平行,室温放置(23°C)。通过显微镜(放大倍数10×)观察,记录每组多子小瓜虫幼虫全部死亡所需要时间。结果显示,浓度为2.5mg/L的PGG药液在228.0±4.5min就能完全杀灭多子小瓜虫感染性幼虫,10mg/L浓度的PGG能在11.6±1.4min内完全杀灭多子小瓜虫感染性幼虫,随着浓度增高,杀灭幼虫时间越短。实施例2:PGG药物对多子小瓜虫包囊的杀灭作用(1)PGG药物的制备方法同实施例1,最终得到浓度为80mg/L的PGG药液。(2)采用二倍梯度稀释法在24孔板中每孔加入步骤(1)制备得到的PGG药液300μL,对照不加药,然后将含有200个多子小瓜虫包囊的300μL的水加入每孔中,使药液终浓度分别为0(对照)、10、20、40和80mg/L,每组设置5个平行。在4倍镜下记录包囊1、2、3和4h的死亡率,计算出EC₅₀(见表2)。4h后将24孔板静置于培养箱中,控温在23°C,经过18h孵化,再统计平均每个包囊孵出幼虫的数量。结果表明:80mg/L浓度的PGG药液在4h内,能100%杀灭多子小瓜虫包囊,尽管40mg/L在4h内没有杀灭所有包囊,杀灭率为87.7±3.6%,但是能完全阻止残存包囊的幼虫孵化和释放,从而阻断多子小瓜虫的传播。10和20mg/L能显著降低每个存活包囊释放幼虫的平均数量。实施例3:低浓度PGG药物对多子小瓜虫幼虫感染力的影响(1)PGG药物的配置同实施例1,最终得到浓度为100mg/L的PGG药液。(2)在18个体积为35L的透明玻璃缸中,分别装入曝气养殖用水5L,每升水中包含40000个感染幼虫,每缸总计200000个感染性幼虫,分别取步骤(1)制备得到的PGG药液25、50、100、250和500μL加入到上述不同缸中,混匀,对照不加药,各缸的药物终浓度分别为0(对照)、0.5、1、2、5和10mg/L,每个浓度3个重复,让感染性多子小瓜虫幼虫在上述药物浓度中分别受药物处理1h。随后每缸内放入10尾从未接触过多子小瓜虫的斑点叉尾鮰(平均全长12.1±1.2cm,平均体重14.9±3.9g)与受药物处理过的感染性幼虫接触感染,平均每尾鱼20000个幼虫。感染2h后加入养殖用水至水位为30L,并开微流水,维持30L不变,温度控制在23±0.5°C,每缸内放1个充气石一直充气。在第7天将每缸鱼分别用150mg/L的MS222(Sigma)麻醉后,检查并记录每尾鱼体表的小白点数,统计感染率和感染强度,两者的计算公式分别为:感染率(%)=(被感染鱼数/总鱼数)×100;感染强度=被感染鱼体表白点总数/被感染鱼数。结果表明:0.5mg/L以上浓度的PGG药物预先处理多子小瓜虫幼虫1h,能显著降低多子小瓜虫幼虫的感染率,甚至完全防止感染发生。当浓度为2mg/L时,感染率仅为10±17.3%(3个平行样),感染强度也很轻,为4.7±8.1,而当PGG药物浓度为5或10mg/L时,感染率和感染强度均为0。表明PGG在较低浓度下就有明显预防效果。实施例4:PGG药物在体杀虫、防病、治病效果实验(1)PGG药物的配置同实施例1,最终得到浓度为100mg/L的PGG药液。(2)设置18个分别装有25L曝气养殖水的透明玻璃缸,每缸均含有5尾感染(每尾鱼体表平均16±6个白点)和10尾未感染的斑点叉尾鮰(规格同实施例3)。其中,5个缸中分别添加步骤(1)制备得到的PGG药液125μL、500μL、1250μL、2.5ml和5ml,对照不加药,PGG终浓度依次为0(对照)、0.5、2、5、10和20mg/L,每个浓度3个重复。每天放去原来含药物的水,再加入同体积新鲜水,加入步骤(1)制备得到的药液,保持药物浓度在换水前后不变,持续用药10天,停药5天。期间,及时清理死亡鱼,并记录死亡鱼数。在第15天将每缸鱼分别用150mg/L的MS222(Sigma)麻醉后,检查并记录每尾鱼体表的小白点数,统计感染率、感染强度和存活率,前两者的计算公式同实施例3,存活率(%)=(第15天存活鱼数/总鱼数)×100。结果见表1。结果分析:在20mg/L的PGG药物浓度处理下,被感染鱼100%的感染率降为13.3±11.5%,存活率为93.3±11.5%,这时的感染率显著低于10mg/L浓度组的80.0±20.0%,存活率显著高于10mg/L浓度组的53.3±11.5%;而未感染鱼的感染率仅为23.3±5.8%,显著低于10mg/L浓度组的63.3±5.8%,存活率为100%,显著高于10mg/L浓度组的70.0±10.0%;0.5mg/L浓度组的鱼全部死亡,无治疗效果;而2mg/L浓度组原来的感染鱼仅有6.7±11.5%存活,原来的未感染鱼仅有13.3±5.8%的存活。所以,20mg/L是PGG在体治疗和预防小瓜虫病的最低有效药物浓度。表1用PGG处理多子小瓜虫感染和未感染斑点叉尾鮰混合体系统计结果ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>“被感染”和“未感染”分别表示“被感染鱼”和“未感染鱼”;“-”表示试验鱼死亡,无试验鱼;感染率(%)=(被感染鱼数/总鱼数)×100;感染强度=被感染鱼体表白点总数/被感染鱼数;同一纵栏内各数值右上角不同字母表示差异显著(p<0.05),相同字母表示差异不显著(p>0.05)。实施例5:PGG急性毒性实验(1)PGG药物的配置同实施例1,最终得到浓度为100mg/L的PGG药液。(2)预实验:测定实验鱼在24h内全部死亡的PGG药液浓度是320mg/L和96h内不发生死亡的PGG药液浓度是80mg/L。(3)在15个35L的玻璃鱼缸中分别装5L养殖用水,其中,4个缸中分别添步骤(1)制备得到的PGG药液4、6、8和16ml,对照不加药,PGG终浓度依次为0(对照)、80、120、160和320mg/L,每个浓度3个平行,每个缸加入10尾斑点叉尾鮰(规格同实施例3)。试验期间随时观察记录死亡鱼数,并统计24、48、72和96h内各个药物浓度下鱼的死亡率,计算半致死浓度(LC₅₀)。LC₅₀及其95%置信区间用概率单位分析(Finny,1971)计算。结果见表2。结果可见,PGG的毒性低,对斑点叉尾鮰的24、48、72和96h半致死浓度(LC₅₀)均为151.3mg/L,是其4h杀包囊的半有效浓度(EC₅₀)30.5mg/L的5倍,所以,对鱼安全。表2PGG离体杀多子小瓜虫包囊效果(EC₅₀)及其对斑点叉尾鮰的急性毒性(LC₅₀)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例6:PGG杀灭多子小瓜虫的机理分析先将多子小瓜虫感染性幼虫和成虫分别在10mg/L和80mg/L的50μlPGG药液中处理致死,对照不处理(活虫),再用2μl吖啶橙(100μg/ml)和2μl碘化丙啶(250μg/ml)混合染色多子小瓜虫幼虫(5min)和成虫(40min),最后用倒置荧光显微镜观察和拍照(见图1和图2)。结果发现:没用PGG药物处理的幼虫和成虫,其细胞膜通透性正常,染成绿色(图1a,1b;图2a);而用药物处理的幼虫和成虫,其细胞膜通透性增加,染成红色(图1c,1d)或橘红色(图2b)。表明PGG杀灭多子小瓜虫机理为损伤多子小瓜虫细胞膜,增大膜通透性。上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。